在您的科研生涯的某個時候，都有可能會用到熒光顯微鏡。這種無處不在的技術改變了顯微鏡學家對研究對象進行成像、標記和追蹤的方式，不論是整個生物體，還是單個蛋白質等等。
通過本文，我們將探討什么是“熒光"，包括其定義背后的歷史和基礎物理原理，綠色熒光蛋白（GFP）的發(fā)現(xiàn)和應用，并展望量子點等熒光探針不斷擴大的應用領域。


我們如何定義“熒光"？
在任何搜索引擎中輸入“熒光的定義"，你會得到以下語句，或者非常相似的內容；
“由較短波長的入射輻射，如X射線或紫外線，某些物質會發(fā)出可見或不可見的輻射。"
這個定義與熒光顯微鏡（圖1）有何關聯(lián)呢？“波長較短的入射輻射"只是用來“激發(fā)"樣品發(fā)射熒光的光源。這種光線包括可見光、紫外線（UV）和紅外線（IR），顯微鏡的光源可以是汞或氙弧光燈，也可以是激光。熒光基團（即上述定義中的“某些物質"）是具有特殊性質的化合物，它們在較短波長光線的激發(fā)下，可以再次發(fā)射較高波長的光線/光子。

 
圖1：熒光顯微鏡下顯示的熒光標記細胞。
波長的基本單位是米，“波長"定義為光波的兩個連續(xù)波峰或波谷之間的距離。波長的符號是希臘字母λ(l)。顯微鏡使用的波長通常以納米（nm）為單位，可見光譜段在400至700納米之間，紫外光譜段在400納米以下，紅外光譜段從700納米開始（圖2）。

 
圖2：可見光光譜
熒光基團按其激發(fā)和發(fā)射波長分類，通常以圖形的形式顯示最大波峰。熒光基團在所謂的“基態(tài)"中自然穩(wěn)定。它們吸收到（來自“較短波長"入射光的）光子時，光子的能量將熒光基團的電子提升到更高能量的“激發(fā)"狀態(tài)。被激發(fā)的電子不會保持在這種狀態(tài)，而會失去振動能量，并在返回基態(tài)時發(fā)射出一個較長波長的光子。對于顯微鏡使用熒光基團，從激發(fā)到返回基態(tài)的一個完整周期需要0.5到20納秒。
熒光基團的激發(fā)和發(fā)射波長通常縮寫為希臘字母lambda，加上下標“ex"（激發(fā)）或“em"（發(fā)射；即lex或lem）。
每個熒光基團都有一個不同的最大激發(fā)和發(fā)射譜段，這一特性用來區(qū)分同一樣品中的不同標靶。例如，使用熒光染色劑DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚）高亮顯示細胞中的核蛋白，同時使用熒光標記的鬼筆環(huán)肽來高亮顯示肌動蛋白細胞骨架。
熒光的雅布隆斯基圖
波蘭物理學家亞歷山大·雅布隆斯基（Aleksander Jablonski，1898-1980）首先用三能級能量圖描述了基態(tài)/激發(fā)/發(fā)射之間的循環(huán)，因此稱為“雅布隆斯基圖"。  1930年，他憑借題為《關于激發(fā)光波長變化對熒光光譜的影響》的論文獲得華沙大學博士學位。1933年，他在《自然》雜志上發(fā)表了自己的論文（《染料中反斯托克斯熒光的效率》"），其中含有雅布隆斯基圖。這種簡單而有效的示意圖清晰表現(xiàn)出熒光基團從基態(tài)到激發(fā)態(tài)的激發(fā)行為，然后在發(fā)射較長波長光子后回到基態(tài)（圖3）。

 
圖3：熒光雅布隆斯基圖。熒光基團會吸收光子。光子的能量將熒光基團的電子提升到更高能量的“激發(fā)"狀態(tài)。隨后，激發(fā)的電子失去振動能量，并在返回基態(tài)時發(fā)射一個較長波長的光子。
 
雖然圖3是簡化版的雅布隆斯基圖，但應該可以注意到，熒光基團可以存在多個不同的激發(fā)和發(fā)射狀態(tài)。此外，熒光基團可以通過不同的弛豫狀態(tài)返回基態(tài)，這些弛豫狀態(tài)被稱為“三重態(tài)"，具體取決于分子的電子自旋。
斯托克斯位移
喬治·加布里埃爾·斯托克斯爵士（1819-1903）是愛爾蘭數(shù)學家和物理學家，他一生中在光學和光線領域頗有建樹。1849年他受命擔任劍橋彭布羅克學院的盧卡斯數(shù)學教授，并一直擔任該職務，直到1903年離開。他寫了一篇文筆優(yōu)美的描述性論文，發(fā)表于1852年，名為《論光的折射性的變化》[1]。他在論文中使用的語言不同于我們在現(xiàn)代科學文獻中使用的語言。以下是斯托克斯爵士所用精彩語言的兩段簡短摘錄；
“去年深秋，雖然因為節(jié)氣遲來，觀察機會不多，我從不同渠道得知，之前提到過的那種具有高內色散性的黃色玻璃采用氧化鈾染色。"
以及：
“看到試管在浸入不可見光線的瞬間點亮，這當然是一個奇怪的景象：那實際上是可見的黑暗?？偟膩碚f，這種現(xiàn)象有點不可思議。"
“斯托克斯位移"這詞就是為了紀念這位科學家。當激發(fā)的電子回到基態(tài)并發(fā)出光子時，其波長始終大于激發(fā)熒光基團的入射光線的波長。這是由于光的特性，即波長與輻射能量成反比。斯托克斯位移描述了熒光基團的峰值激發(fā)波長和峰值發(fā)射波長之間的差值（以納米為單位）（圖4）。

 
圖4：斯托克斯位移發(fā)射光的波長始終大于用來激發(fā)熒光基團的光線波長。
增加斯托克斯位移，熒光基團的激發(fā)光和發(fā)射光之間區(qū)別就越明顯。熒光基團的電子排布和分子結構令其在斯托克斯位移方面有著*的性質。
綠色熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)與應用
斯托克斯爵士首先使用“熒光"這個術語來描述他觀察到的現(xiàn)象，但其發(fā)現(xiàn)可以追溯到1565年。來自西班牙的醫(yī)生兼植物學家尼古拉斯·莫納德斯（Nicolas Monardes）描述了一種墨西哥樹（Lignum nephriticum），其木頭被注入了奇怪的藍色。盡管有這些早期的觀察，但直到約400年后，人們才在活體組織中找到一種綠色熒光物質。1955年，Davenport和Nicol發(fā)表論文[2]，描述了一種在稱為水螅水母（Hydromedusae）的水母亞綱生物的嗜酸性粒細胞中找到的發(fā)光組織。當時，兩位論文作者并沒有意識到這些嗜酸性粒細胞含有綠色熒光蛋白（GFP）。
直到1962年，下村脩（Osamu Shimomura，出生于1928）發(fā)表了一篇論文[3]，認定這種發(fā)光成分是一種蛋白質。通過與他在普林斯頓大學的老師（弗蘭克·*教授）合作，他們從生物發(fā)光水母Aequorea Victoria（維多利亞多管發(fā)光水母）身上收集到樣本。他們用一種*的方法從水母中分離出熒光蛋白，即通過棉布袋擠壓分離的生物發(fā)光組織，產(chǎn)生一種被下村稱為“擠壓物"的溶液。
1994年，哥倫比亞大學的馬丁·查爾菲（Martin Chalfie，出生于1947年）教授發(fā)表論文，證明了基因編碼GFP可以在原核細胞和真核細胞（即大腸桿菌和秀麗隱桿線蟲的神經(jīng)元）中實現(xiàn)功能表達[4]。該論文寫道“由于這種熒光不需要外源底物和輔助因子，GFP表達可以用于監(jiān)測生物體內的基因表達和蛋白質定位。"正是這篇文章的發(fā)表為GFP在生物學研究中的廣泛應用鋪平了道路。

 
圖5：線蟲，GFP在神經(jīng)系統(tǒng)中的表達。
一年后，一直在研究野生型GFP突變體的加州大學圣迭戈分校教授錢永?。?952-2016）在《自然》的科學通訊上發(fā)表了自己的論文[5]。錢教授和他的同事發(fā)現(xiàn)，他們選擇的一個單點突變（S65T）具有最長的激發(fā)和發(fā)射波長(490/510nm)，這令它更具有光穩(wěn)定性，并帶來大家都知道的GFP激發(fā)/發(fā)射峰。
2008年，下村脩、錢永健和查爾菲因在GFP的發(fā)現(xiàn)和應用方面發(fā)揮的重要作用共同獲得諾貝爾化學獎。下村脩在他的諾貝爾演講中表示，“當我在1979年發(fā)現(xiàn)GFP的發(fā)色團時，我認為自己已經(jīng)完成了所有研究工作，因而決定終止我在GFP方面的工作，以便集中精力研究生物發(fā)光"。他接著承認，“GFP是一種美麗的蛋白質，但在發(fā)現(xiàn)之后的30年中，它依然百無一用。"
自從錢永健發(fā)現(xiàn)GFP的應用之后，他的實驗室已經(jīng)設計出多種GFP變體，涵蓋了大部分的可見光譜，并*改變了光學顯微鏡和成像領域。得益于這種基因工程，GFP的色彩范圍從光譜的藍色譜段（EBFP；380/460納米）到光譜的黃色譜段（YFP；514/527納米）。
報告基因和探針
除了成像領域，熒光團可以作為研究細胞和生物體中基因表達的“報告基因"。熒光素酶以及基因編碼GFP，就是檢查細胞是否表達特定基因的常用報告基因。生物體或細胞被基因改造的病毒DNA或質粒轉染，當目標基因獲得表達時，這些質粒會發(fā)出熒光。細胞內部的相關細胞器或位點可以在受轉染的細胞中進行觀察和檢查。
利用熒光基團標記（或“標注"）的抗體通常稱為“熒光探針"。在GFP和其他熒光基團得到廣泛應用之前，兩種常用的熒光基團標記抗體是FITC（異硫氰酸熒光素）和TRITC（異硫氰酸四甲基羅丹明）。盡管FITC和TRITC仍在使用，但該領域已取得重大進展，至少可以說，熒光基團和探針的選擇非常廣泛。
當然，如今實驗室中使用最為廣泛的熒光基團之一是“Alexa Fluor"染色劑。目前Alexa Fluor染色劑的可用色彩范圍已超越可見光譜，其中激發(fā)波長范圍可達346至784納米。
量子點
1981年，俄羅斯科學家阿列克謝·埃基莫夫（Alexey Ekimov）在圣彼得堡瓦維洛夫國立光學研究所工作時，第一次在玻璃基質中發(fā)現(xiàn)了量子點。然而，在新澤西州AT&T貝爾實驗室從事半導體工作的路易斯·布魯斯（Louis Brus）首先發(fā)現(xiàn)了量子點膠體溶液。他現(xiàn)在是哥倫比亞大學化學系教授。在1983年和1984年發(fā)表的兩篇論文中，布魯斯將量子點描述為“小型半導體微晶"。
量子點有著奇特的行為方式，盡管它們包含100到10萬個原子，但它們表現(xiàn)出的性質就像它們由單個原子組成一樣。當然，它們確實符合熒光基團的性質，即它們可以吸收光能并激發(fā)，然后在返回基態(tài)時釋放光子。不過，量子點發(fā)射光線的波長取決于量子點的大小，即量子點越小，發(fā)射波長就越短。這種特性是因為較小的量子點具有較大的“最小帶隙"。這正是激發(fā)電子到更高能態(tài)所需的能量。由于較小的量子點需要更多的激發(fā)能量，它們隨后會發(fā)射較短波長的光（波長與激發(fā)能量成反比）。
大約20年后，即2002年，加州量子點公司的生命科學研究人員實現(xiàn)了量子點的商用開發(fā)。
量子點是一種非常明亮且穩(wěn)定的熒光工具。研究表明，量子點的的亮度比傳統(tǒng)熒光基團高幾個數(shù)量級，盡管與有機染料相比，量子點的明亮程度存在一些差異[6]。就光穩(wěn)定性而言，量子點的穩(wěn)定性是傳統(tǒng)熒光基團的100倍，在一項活體成像研究中，量子點的熒光持續(xù)時間長達4個月[7]。
在傳統(tǒng)熒光探針中，一個或多個熒光基團可以附著在單個相關抗體上。然而，由于量子點的表面積非常大，許多分子和抗體可以附著在單個量子點上，這會帶來許多優(yōu)點，包括熒光信號放大。量子點的使用也為多重分析提供了優(yōu)勢，可以在檢測中同時對各種波長進行成像。在這種分析中，變量是研究者選擇的量子點大小（因此發(fā)射波長）?？梢允褂冒坠馔瑫r激發(fā)大范圍的量子點，這樣就可以避免使用多道激光和多次調整來形成最終影像。